• 2020年04月08日 星期三
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    脂肪细胞分化及脂代谢中的作用

    辜楠1,2,郭锡熔1,2,倪毓辉2,王玢2,张敏2,刘峰2,费莉2,陈荣华2

    (1南京市妇幼保健医院儿科,江苏南京210029;2南京医科大学儿科医学研究所,江苏南京210029)

     

    Resistin是2001年发现的一种新的胰岛素抵抗候选基因,该基因较特异地表达于脂肪组织中,被认为是联结肥胖和2型糖尿病的一个中介分子。先前研究中,我们通过噬菌体表面展示技术(phagedis.play),筛选出了三条5’末端具有相同1lbp核苷酸序列的cDNA,并将其编码的蛋白命名为Resistin结合多肽(ResistinBindingPeptide,RBP);双荧光定位和亲和层析实验均证实了RBP能够与Resistin特异性结合,但RBP对脂肪细胞功能的具体影响尚不十分清楚。为深入探讨RBP在脂肪细胞分化、脂代谢中的作用,并初步观察RBP对脂肪细胞中与葡萄糖摄取密切相关的基因一葡萄糖转运体4(glucosetransporter4,GLUT一4)表达的影响,本研究在已经证实向3T3一L1前体脂肪细胞转染Resistin表达载体可明显促进3T3一L1脂肪细胞分化的基础上,分别以3T3一L1前体脂肪细胞和稳定表达Resistin基因的3T3一L1前体脂肪细胞株为研究工具,以三条多肽的共同序列AWIL体外合成一短肽后对两组细胞进行直接干预,观察RBP对脂肪细胞分化、脂代谢功能以及GLUT一4基因表达的影响。

     

    1、材料与方法

    1.1

    RBP短肽合成序列5’-AWIL-3’,由上海生工生物工程有限公司合成(95%纯度、10mg),1mg/管分装。实验前用2mg“超纯抽汽水溶解1mg多肽,配制成2×10-3mol/L的贮存浓度,并分装。

    1.2

    Resistin基因稳定表达脂肪细胞株的获得采用RT—PCR法扩增大鼠Resistin基因全编码区cDNA片段,所用引物序列如下,上游BamHI5’一GCAGGATCCATGAAGAACCTTTCAT一3’,下游)XHoI5’-TATCTCGAGCGGGAACCAACCCGC一3’,产物大小362bp,BamHI和XhoI双酶切后插人poDNA3.1B表达载体(Invitrogen公司)。转化JMl09感受态大肠杆菌(Promega公司)后挑单克隆测序鉴定,测序正确后抽提质粒转染3T3一L1前体脂肪细胞,G418筛选稳定表达细胞株后WestemBlotting验证Resistin蛋白表达。

    1.3

    台盼蓝排斥试验测定细胞活力不同浓度的RBP(10-6mol/1—10_14mol/1)加入脂肪细胞培养基中干预24小时后,用血球计数板分别计死细胞和活细胞数,计算活细胞率(%)即细胞活力。

    1.4

    3T3一L1脂肪细胞的培养、诱导分化与鉴定根据3T3一L1细胞培养和诱导分化方案,将3T3一L1脂肪细胞(中国科学院廖侃教授馈赠)生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM(GIBCO公司)完全培养液,在37℃、5%C02培养箱中生长,每2天换液1次,待细胞生长至完全融合后两天(Day0),加入0.5mMMIX、5ug/ml胰岛素和1uM地塞米松诱导分化。两天后(Day2)换用仅含5ug/ml胰岛素的完全培养基,再两天后(Day4)换完全培养基,以后每两天换液一次直至第10天细胞完全分化成熟。RBP干预组于细胞分化第0天起加入10~12mol/1的RBP直至细胞分化成熟。在细胞分化第0、2、4、8天,用油红o染色观察脂肪细胞浆中脂滴的形态,同时在诱导分化的不同时段,分别收集细胞,一70℃冻存备用。

    1.5

    RT—PCR检测脂肪细胞中基因的表达Trizol一步法提取3T3一L1细胞的总RNA,经电泳显示28S、18S和5S清晰3条带,测定OD260/OD280比值大于1.8。定量后取总RNAlug,以Oligo(dT)15为引物进行逆转录反应,反应体系20ul。取逆转录产物lul为模板进行PCR扩增,PCR反应体系20ul。95%预性5min,94℃变性30s,Ta℃退火30s,72℃延伸1min。所用引物及PCR反应条件参考有关文献。所选用PCR反应的模板量及循环数均使PCR产物量位于反应曲线的线性范围内。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,以UVP凝胶密度扫描仪对各基因特异性扩增产物的电泳条带进行密度扫描,用Labwork3.0软件分析电泳条带密度值,基因mRNA的表达水平以该基因条带密度占B一actin基因条带密度的百分率(%)表示。

    1.6

    脂肪细胞内TG、FFAs含量的检测收集分化第10天的成熟脂肪细胞,裂解细胞,收集胞内蛋白,全自动生化仪比色法检测脂肪细胞内TG、FFAs含量(江苏省人民医院检验科完成)。

    1.7

    统计学处理数据以均数±标准差(X±S)表示,并采用SPSSll.0统计软件进行数据整理和统计。两小样本均数之间的比较,经方差齐性分析F检验后,选择t或t’检验;P2结果

     

    2.1

    RBP干预浓度的确定脂肪细胞活力检测显示,不同浓度RBP干预24h后,RBP浓度为10~12mol/L时,活细胞数比例较高,且细胞形态无明显改变;且该浓度与10~14mol/L浓度相比活细胞数比例无显著差异,与其余浓度比较活细胞比例均有差异,故确定10-12mol/L浓度为RBP干预的理想浓度,见表1。

    1不同浓度RBP干预后的活细胞比例(%,X±s)

    RBP浓度(mol/L)
    活细胞比例(N=6)
    10-6
    83.80±2.05
    10-8
    89.58±1.91
    10-10
    92.90±1.99
    10-12
    95.35±1.16
    10-14
    95.70±0.96
    F
    51.909
    P
    <0.01


    2.2

    RBP对3T3一L1脂肪细胞分化进程的影响诱导分化前,3T3一L1前体脂肪细胞呈梭形成纤维细胞形态,胞浆内未见亮红色脂滴;细胞生长至完全融合后两天(第0天)开始诱导分化,第2至第6天细胞形态发生明显变化,细胞逐渐由梭形变为圆形,胞体变大变圆;第4天时,胞浆中开始出现亮红色的脂滴,并逐渐增多增大;至分化第8天,细胞增大,呈圆形或椭圆形,90%以上的脂肪细胞均已分化成熟。10-12mol/1的RBP干预后显示,3T3一L1脂肪细胞分化进程、细胞形态无明显改变,脂滴出现时间及脂滴大小也均无明显变化。

    大鼠Resistin基因转染3T3一L1前体脂肪细胞并诱导分化后,胞浆中脂滴出现时间提前,分化第2天即可见胞浆中出现亮红色的小圆形脂滴,并随分化进程胞内布满小而多的圆形脂滴。10~12mol/L的RBP干预后显示,与Resistin稳定表达细胞相比,分化各天的细胞浆中脂滴数均明显减少,但脂滴出现的时间并无明显变化(仍为第2天),脂滴形态也无明显改变(仍为小圆形的亮红色脂滴)。

    2.3

    RBP对脂肪细胞分化标志基因mRNA表达的影响RT—PCR结果显示,RBP干预对3T3一L1脂肪细胞分化进程中早期标志基因Pref一1、中期标志基因C/EBPa、晚期标志基因FAS的mRNA表达水平均无显著影响,见图1。

    2.4

    RBP对脂肪细胞内TG、FFAs含量的影响10-12mol/L的RBP干预后,成熟脂肪细胞内的TG、FFAs含量均无显著性差异,见表2。

    大鼠Resistin基因转染3T3一L1前体脂肪细胞并诱导分化后,Pref一1基因表达明显下调。C/EBPA、FAS基因表达水平明显上调。10-12mol/1的RBP干预后发现,与Resistin稳定表达细胞相比,分化早期的Pref一1基因表达虽无明显变化,但中晚期C/EBPa和FAS基因的表达均明显下调,见图2。


    图1  RBP干预对正常脂肪细胞分化标志基因mRNA表达的影响

    表2 RBP干预后3T3一L1成熟脂肪细胞中TG、FFAs含量(夏±s)

    RBP浓度(mol/l)
    n
    TG(umol/l/104个细胞)
    FFAS( mmol/l/104个细胞)
    3T3
    6
    2.84±1.35
    1.12±0.06
    BRP-3T3
    6
    1.81±0.77
    1.08±0.16
    F
    -
    1.6151
    0.6053
    P
    -
    >0.05
    >0.05

    大鼠Resistin基因转染3T3一L1前体脂肪细胞并诱导分化后,成熟脂肪细胞内TG、FFAs含量均显著增加。10-12mol/L的RBP干预后发现,与Resistin稳定表达细胞相比RBP干预后成熟脂肪细胞内TG、FFAs含量均显著下降,见表3。

    2.5

    RBP对脂肪细胞GLUT一4基因mRNA表达的影响liT—PCR结果显示,RBP干预正常脂肪细胞、Resistin稳定表达脂肪细胞和RBP干预的转染细胞中,GLUT一4基因的表达水平均无显著差异,见表4。

     

    3RBP干预Resistin稳定表达的成熟脂肪细胞中TG、FFAs含量(X±5)

    RBP浓度(mol/l)
    n
    TG(umol/l/104个细胞)
    FFAS( mmol/l/104个细胞)
    Resistin3T3
    6
    4.31±1.61
    1.13±0.05
    BRP-resistin3T3
    6
    6.06±0.92
    1.28±0.12
    F
    -
    0.9132
    7.3418
    P
    -
    >0.01
    >0.01

    注:。P<0.05,一P<0.01versusResistin稳定表达脂肪细胞。

    图2RBP干预resistin稳定表达脂肪细胞后分化标志基因mRNA的表达变化(**P<0.01)

     

    3、讨论

    近年来,一系列的研究均已证实Resistin与胰岛素抵抗之间存在重要联系,肥胖个体内高水平的Resistin是引起胰岛素抵抗各种症状的重要因素之一,Resistin也因此被认为是联结肥胖和2型糖尿病的一个中介分子。

     

    4各组脂肪细胞中GLUT一4基因mRNA的表达水平(X±S)

    级别
    n
    分化第2天
    分化第4天
    分化第8天
    p
    3T3-LI细胞
    6
    1.07±0.05
    1.09±0.14
    1.07±0.08
    >0.05
    Resisrin转染细胞
    6
    1.09±0.03
    1.07±0.10
    1.09±0.11
    >0.05
    RBP干预正常细胞
    6
    1.07±0.06
    1.08±0.05
    1.10±0.10
    >0.05
    RBP干预转染细胞
    6
    1.06±0.09
    1.01±0.07
    1.02±0.09
    >0.05

     RBP是我们筛选出的能与Resistin特异性结合的蛋白,为深入探讨RBP在脂肪细胞中可能发挥的作用以及对Resistin功能的影响,本研究综合考虑多肽合成的可能性和溶解性后,选择三条多肽的共同序列5’一AWIL一3’体外合成一短肽后对3T3一L1脂肪细胞进行直接干预,观察RBP对脂肪细胞分化、脂代谢功能以及GLUT一4基因表达的影响。

    结果发现,RBP对正常脂肪细胞的分化、脂代谢及GLUT一4基因的表达均无显著影响鉴于Resistin基因特异表达于脂肪细胞中,肥胖时脂肪细胞中Resistin表达明显上调,因此,本文推测可能与正常脂肪细胞合成与分泌Resistin量较少、RBP无法有效展示其功能有关。

    然而,当RBP干预了Resistin稳定表达的3T3一L1脂肪细胞株后,RBP则可显示其拮抗Resistin的作用。具体表现为:①Resistin基因转染后3T3一L1脂肪细胞的分化进程明显加快、细胞内脂滴出现时间提前、脂滴数目增加,与先前研究结果一致,同时加入RBP则能够明显抑制其分化进程,并呈现成熟脂肪细胞中脂滴数目明显减少的现象;②RBP干预可显著下调脂肪细胞分化中晚期标志基因C/EBPa和FAS在Resistin稳定表达脂肪细胞中的表达,然而有关早期Pref一1基因表达水平无.明显改变的意义目前尚无恰当的解释;③RBP可拮抗Resistin过表达对成熟脂肪细胞内TG、FFAs含量的影响,RBP干预后Resistin稳定表达的成熟脂肪细胞内TG、FFAs含量显著下降。

    现已知,过多脂肪细胞分化是肥胖发生发展中重要的病理生理学基础之一,脂质积聚不但是肥胖发生发展的中心环节,而且脂质积聚过程中常伴有脂质代谢的异常,可过多释放FFAs,通过Randle’s假说导致胰岛素抵抗的发生。Resistin基因转染后,脂肪细胞的分化加快,成熟脂肪细胞中脂滴数目和TG含量增加,过多的脂质积聚可导致脂解同步增加,使脂肪细胞内FFAs含量显著增加,并可分泌人血从而导致胰岛素抵抗的发生。本研究显示,RBP干预可明显拮抗Resistin基因促进脂肪细胞分化及增加脂肪细胞内脂质积聚的作用,从而提示Resistin应与脂肪细胞分化和脂质代谢功能密切相关,RBP则能够通过与Resistin相互结合从而拮抗其作用;因此RBP不但在肥胖防治过程中可能发挥重要作用,而且还可能通过干扰脂肪细胞中游离脂肪酸的代谢从而延缓胰岛素抵抗的发生。因此,本文认为上述结果为RBP作为肥胖治疗或抗糖尿病多肽药物的开发提供了进一步的支持依据。

    鉴于现有文献表明,Resistin能通过抑制脂肪细胞、肌细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取从而破坏葡萄糖稳态,引起胰岛素靶组织对胰岛素敏感性的下降,而RBP对脂肪细胞糖代谢的影响尚不清楚,由于GLUT一4基因是一个与肝脏、骨骼肌、脂肪组织等胰岛素靶组织的葡萄糖摄取密切相关的基因,因此本研究运用RT—PCR技术检测了RBP干预前后脂肪细胞中GLUT一4基因的表达变化。结果发现,在3T3一L1脂肪细胞、Resistin稳定表达脂肪细胞和RBP干预的转染细胞三组问,分化各时间点的GLUT一4基因表达均无显著变化,但其机制目前尚无满意解释。有文献报道,Resistin基因对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的抑制作用并不依赖于GLUT一4基因的转运,GLUT一4基因mRNA表达变化与胞膜GLUT一4蛋白表达的变化并非完全一致,因此,本文分析认为,RBP对脂肪细胞糖代谢功能的影响可能不依赖于GLUT一4基因的表达变化,其机制将通过进一步的实验研究分析。