• 2020年04月08日 星期三
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    卫生检验专业委员会

    韩卫宁

    (苏州市疾病预防控制中心,江苏苏州215004)

     

    随着人类基因组计划(HGP)完成和数量巨大的遗传信息的获得,人们的兴趣转向了解个体之间基因的差异性,以及这种差异如何影响不同个体对疾病的敏感性及对药物的反应性。在公共卫生领域,也需要对引起突发公共卫生事件如不明原因的传染病的病原进行快速筛查。这都需要对DNA样品进行快速、可靠、经济和高通量的检测。美国纳斯达克上市的Luminex公司研发的LuminexxMAPTM(flexiblemulti—analyteprofiling)技术,又被称为多功能流式点阵技术、微球依赖的悬浮点阵技术、液相芯片技术,为高通量的核酸分析提供了新的平台。与固相芯片相比,液相芯片具有操作简单,花费较低,重复性好,杂交动力学快,微阵列应用灵活等优点。液相芯片技术不但为后基因组时代的科学研究提供了强大的技术支持,也为高通量分子诊断提供了良好平台。2005年6月9日,基于xMAP技术的学术论文刊登在当日出版的《自然》杂志上,这是学术界认可一项技术所能给予的极高荣誉。2005年11月为了表彰其对临床诊断技术作出的革命性贡献,全球科技产业和行业研究的权威机构FroSt(Sulliva授予xMAP技术“2005年度国际临床诊断技术革新大奖”。本文就xMAP技术在核酸检测中的分析原理和应用现状作一

    介绍。

     

    1、LuminexxMAP技术原理

    LuminexxMAP系统使用大小均一的5:6/an聚苯乙烯微球,每个微球在制作过程中按严格的比例精确掺入两种不同的红色分类荧光染料,每种染料各有10种浓度,根据这两种红色分类荧光的比例不同,可以把微球分为100种,这样每个微球都有了一个光谱地址。在每个微球表面可以进行不同的反应,使得可以在一个反应管里同时进行并检测100种不同的反应。第三种荧光素偶联在报告分子上,对发生在微球表面的反应进行定量。微球排成单列被快速液流传送通过Luminexl00TM分析仪的两束激光。635nm/lOmW的红色二极管激光激发微球中的分类荧光染料,确定被测物的特异性(定性);532nm/13mW的钇铝石榴石激光(YAC)激发结合在微球表面的报告荧光素(如藻红蛋白、ALexa532、Cy3等),从而确定被测物的量(定量),所得到的数据经电脑处理后可直接判断结果,见图1。

     

    2、LuminexxMAP分析模式

    2.1

    直接DNA杂交以PCR扩增并标记靶DNA,使其与负载在微球上的互补捕获探针直接杂交。与固相芯片相比,液相芯片中的捕获探针扩散率快,有效浓度更高。使用xMAP悬浮点阵进行直接杂交分析时,通常使用含有四甲基氯化氨(TMAC)的杂交缓冲液,因为TMAC会稳定AT碱基对,最大程度地降低碱基成分对杂交的影响。长度大于200碱基对的寡核苷酸在TMAC中的杂交效率,较多地依赖于碱基互补程度,而较少依赖于碱基组成。含有3M或4MTMAC的杂交缓冲液会平衡不同探针的熔点,使得在同样的杂交条件下,可以同时使用不同特性的探针。

    直接杂交是鉴别单核苷酸差异的最简单方法,其优势在于,15~20核苷酸的肽段与完全互补的模板杂交时的解链温度,比和有一个碱基错配的模板杂交时的解链温度时要高好几度。在单核苷酸鉴别分析中,典型的捕获探针通常由20个核苷酸组成,和标记的PCR产物链互补。探针的解链温度受长度、序列、错配碱基的位置和类型影响。随着温度的增加和探针长度变短,杂交中错配的影响增大。通过提高杂交温度和/或减少探针长度,可以提高鉴别的质量。在标准杂交条件下对已知DNA样品进行测试后,向探针的5’或3’端添加核苷酸以提高敏感性,或从5’或3’端去除核苷酸以提高特异性。单核苷酸多态性(SNP)或突变位于探针的中部与靠近探针5’或3’端相I:L,中部的错配对平衡状态的影响更大。可以调节突变在探针中的位置以避开二级结构。当突变位于20核苷酸探针的第8~14位时,都能达到足够的特异性。

    1微球依赖的亘援杂交分析模式圈
    DNA经PCR扩增,其中一个引物生物素化,扩增产物变性,与等位基因特异性探针偶联的微球系统杂交,以链霉亲和素一R一藻红蛋白标记后检测。
    PCR引物对含有SNP或突变位点的100—300碱基对的DNA区间进行扩增,引物中的一个在5’端生物素化,以标记扩增的靶DNA。较短的靶DNA能降低空间位阻对杂交效率的影响。此外,确定靶基因浓度范围很重要,合适的靶DNA浓度能提高杂交的效率而不影响分辨率。当靶DNA超过饱和浓度时,由于互补链的竞争和PCR产物的复性,杂交效率下降。通过调整杂交温度、探针长度、靶分子浓度,可在分析的敏感性和特异性上达到最佳条件。
    2.2
    竞争性DNA杂交在探针和靶基因设计上,竞争性杂交和直接杂交相同。但在竞争性DNA杂交中需要构建一种荧光标记的竞争性寡核苷酸,其与偶联在微球表面的特异性捕获探针互补。竞争杂交时,非标记的双链PCR扩增产物与标记的竞争性寡核苷酸与微球上的捕获探针竞争退火。当不加样本(不含目标序列)时,可以在微球上检测最大的荧光强度;如果加入样本(含目标序列),目标序列会与荧光标记的互补寡核苷酸结合,从而降低了微球表面荧光强度,而且加入的目标序列的量和荧光强度的降低存在比例关系。当不可能或不方便通过PCR或其他方法直接标记靶核酸时,就可使用这种分析模式,见图2。
    2.3
    液相化学反应结合微球捕获在这种模式中,先以PCR扩增出待检靶分子DNA,然后通过液相中的酶反应(碱基延伸反应或DNA连接反应)向靶DNA偶联特异性捕获序列,再与微球表面的互补寻址探针杂交后进行检测,见图3。这一分析模式对靶基因型的确定主要依赖于DNA多聚酶和DNA连接酶的分辨能力,包括等位基因特异性引物延伸(ASPE),寡核苷酸连接分析(OLA)和单碱基链延伸(SBCE)等3种方法,见图4。下面我们以SBCE为例对基于溶液的的微球捕获反应分析模式作较详细的说明。
    ①PCR扩增:以待检样品基因组为模板,以引物扩增出含有SNP或突变的待检DNA片断。
    ②以SAP(虾碱性磷酸酶)、ExoI(核酸外切酶I)处理PCR扩增产物,降解PCR引物和dNTP,然后热灭活Taq酶。
    ③SBCE反应:反应体系包括:Tris—HCl,MgCl2,Taq酶,模板(含有SNP位点的双链PCR产物),每一等位基因特异性的荧光素F1TC标记的ddNTP,其他三种ddNTP,偶联了捕获探针的引物。针对每个SNP位点,设计具有唯一序列的捕获探针,用于分析一对等位基因。针对不同的SNP,使用不同的捕获序列,可以进行多通道SNP分析。
    ④与微球杂交:SBCE完成后,加入负载了与捕获探针互补的寻址探针和通用荧光素酶序列(SeqLUC)的微球,与SBCE产物杂交。⑤流式细胞仪分析。


    图2微球依赖的竞争性杂交分析模式图
    左: 不含靶DNA时,生物素化的竞争性寡核苷酸与等位基因特异性探针偶联的微球系统杂交,以链霉亲和素一R一藻红蛋白标记后检测,获得100%的荧光信号; 右:存在靶DNA时,生物素化的竞争性寡核苷酸与靶DNA杂交,而不与等位基因特异性探针偶联的微球系统杂交。靶DNA/竞争性寡核苷酸杂交物以链霉亲和 素一R一藻红蛋白标记,导致等位基因特异性探针偶联的微球系统荧光信号的降低。


    3液相化反应合微球捕获的基因分型模式图

    A.进行液相酶反应,向产物偶联唯一的捕获序列;B.寻址探针偶联的微球系统;C.通过捕获序列和寻址探针的杂交使产物捕获于微球系统,以链霉亲和素一R一藻红蛋白标记后检测。

    SBCE中,引物的3’端定位于SNP或突变上游1个核苷酸处,而在ASPE和OLA,引物的3’端恰与SNP或突变位点对应。在ASPE中,通过加人dNTPs(其中一个用生物素标记),以热稳定性多聚酶用于延伸引物。只有引物的3’端核苷酸与模板互补并退火到模板DNA上时,延伸才能发生。在OLA中,当一个生物素标记的寡核苷酸(报告探针)与SNP或突变的下游序列互补时,使用热稳定的连接酶,能将标记的报告探针连接在引物上。探针的5’端磷酸化,为连接酶提供底物,3’端以生物素标记,用于荧光素检测。

    液相化学反应结合微球捕获的分析模式通过在酶反应步骤向等位基因特异性引物偶联合适的捕获序列,使得可寻址的微球系统能用于多种不同的分析,可以确定不同的靶序列。



    4同靶DNA偶联捕获序列的ASPE。OLA和SBCE反应模式图.

    ASPE:1.靶DNA与偶联了捕获序列的等位基因特异性引物结合并变性;2.靶DNA和引物在含有DNA多聚酶和dNrrPs(其中一种生物素化)的反应体系中退火;3.引物延伸;4.偶联了ASPE产物的捕获序列。OLA:1.靶DNA与偶联了捕获序列的等位基因特异性探针结合并变性;2.靶DNA和探针在含有DNA连接酶和生物素化报告探针的反应体系中退火;3.寡核苷酸连接;4.偶联了SBCE产物的捕获序列;

    SBCE:1.靶DNA与偶联了捕获序列的引物(针对每个等位基因分别反应)结合并变性;2.靶DNA和引物在含有DNA多聚酶和一种生物素化的ddNTPs的反应体系中退火;3.引物的单碱基延伸;4.偶联了SBCE产物的捕获序列。

     

    3、应用

    3.1

    SNP基因分型SNP是人类基因组中最广泛的序列变化,为鉴定疾病提供了特异性位点,也是预测疾病和药物敏感性的重要标志。直接杂交法和OLA、SBCE以及ASPE法被广泛用于SNP基因分型。

    Armstrong等建立了一种32通道的直接杂交SNP基因分型技术,能同时确定8个不同多态性基因的基因型。针对每种多态性设计4种不同的等位基因特异性寡核苷酸(ASO),每一个ASO在多态性位点含有1个不同的碱基。当荧光素标记的PCR产物与ASO完全互补时直接杂交,并被捕获在负载ASO的微球上。使用Luminex○RFlowMetrixTM系统通过流式细胞术分析反应,通过信噪比分析来确定基因分型,荧光信号最强的微球代表靶DNA的基因型。结果与TaqMan所获的结果进行比较,对39个基因型的检测完全正确。

    Iannone等使用OLA法对来自7个DNA样品的、定位在ApoE位点附近的9个SNPs进行基因分型。他们比较了18通道分析的结果和单通道分析的结果,发现在多通道分析中并没有损失荧光信号。他们认为多通道分析具有高通量、快速、精确和反应试剂使用充分等优点。

    Chen等使SBCE来确定ApoE基因的58个SNPs的基因型。58个SNPs中的55个在初次实验就被成功分型。他们认为,由于DNA多聚酶的等位基因鉴别的精确性、产物与其编址微球杂交的特异性以及流式细胞仪对各个荧光微球上反应信号读数的敏感性,使得SBCE分析高效而可靠。

    cai等也使用SBCE法对HLADPBl位点的Glu96变异体和HLADPDl位点的SNPs进行基因分型。用这种方法,他们正确地确定了30个样品2条染色体上8个位点的的基因型(即总共480个位点)。他们认为与其他SNP基因分型方法相比,悬浮点阵平台具有几个优点,①能区分结合或不结合的荧光基团,不必使用分离或清洗的步骤;②敏感性高,能分析极低浓度DNA模板;③引物延伸和杂交在溶液中进行,反应快速高效;④能同时对多个特征进行多通道分析。

    Pickering等使用ASPE法,对来自101个样品的全基因组扩增的DNA进行细胞色素P450(CYP)的CYP2C9(*2和*3等位基因)和CYP2C19(*2和*3等位基因)的基因分型分析。结果与eSensorDNA测试系统进行了比较,并经测序确认,两种方法确定的基因型别完全一致。稀释实验表明,1.5ng的核苷酸足以用于PCR和Luminexl00分析。以xMAP确定的等位基因的批内和批间的变异系数(CV)分别≤4.1%和≤9.1%。

    3.2

    遗传性疾病扫描诊断Colines等使用直接杂交对新生儿血DNA的(-球蛋白变异体进行多通道基因分型。Dunbar和Jacobson对来自14个特征性人DNA样品的生物素化的DNA进行多通道直接杂交,在囊性纤维化穿膜调节基因(CFTR)可精确检测5个突变。Hadd等使用3通道的直接杂交分析,确定CFTR基因的内含子8的5T/7T/9T的多态性。这一过程方便快捷,不需要纯化、清洗等步骤,容易操作,结果经DNA测序证明正确。

    多通道直接杂交还被用于分析与血栓形成倾向体质有关的基因突变,是基于xMAP的分析用于研究因子V的506R-Q突变,因子Ⅱ的20210G→A突变,亚甲基四氢叶酸还原酶(MIHIR)的677C→T突变与静脉血栓栓塞风险增加的关系。最近Bortolin等用多通道ASPE法检测了上述及其他3个和血栓形成倾向有关的突变:MTHFR的1298C→T突变,因子VIII的134val→1eu突变,和组织因子途径抑制因子(TFPI)的536C→T突变。总共对132个患者DNA样品进行基因分型,其结果与测序结果完全一致。

    Wallace等建立了一种BAR—CODE—ALL微球点阵编码的急性淋巴细胞白血病分析法,用于检测在儿童淋巴细胞白血病中,由于染色体转位而产生的7个融和转录子。在一个多通道反应中,所有的7种突变都以100%的敏感性和特异性在6小时内被检测出来。

    3.3

    基因表达谱分析Yang等建立了BADGE(基因表达的微球点阵检测)分析法,用生物素化的cRNA与偶联在微球上的互补捕获探针杂交,对拟南芥(Arabidopsis)中特定基因的表达进行定量。结果与由GeneChip探针点阵所获的结果有可比性,敏感性足以检测到中等程度表达的基因(每细胞10到30拷贝)。他们认为微点阵技术适用于对少数样品进行全基因组扫描,TaqMan技术适用于对大量样品的少量基因进行扫描,而BADGE技术对较多的样品进行多达100个基因的扫描则最为理想。

    3.4

    HLADNA分型Fulton等使用多通道竞争性杂交分析对HLA等位基因进行分型,他们合成了16个与HLA—DQAl第二个外显子内等位基因序列对应的寡核苷酸作为探针。与探针序列互补的标记寡核苷酸(竞争性寡核苷酸)先与未标记的双链模板预杂交,再与负载了与等位基因互补的探针的微球系统进行杂交,然后使用LuminexFlowMetrix系统进行荧光分析,与不加标记竞争物时所获的荧光强度进行比较,确定出荧光的抑制率。对照模板对竞争寡核苷酸与其互补微球杂交的抑制在62%到93%之间,而对非互补微球杂交的抑制低于21%。

    3.5

    微生物检测对病原微生物的分子检测广泛应用于公共卫生、水质监控和食品工业等领域,xMAP技术可用于检测细菌,病毒和真菌等病原体。Smith等建立了一种检测病毒核酸的多通道分析方法,即同时扩增HIV、HCV和HSV的内部扩增对照与病毒序列,并与负载了针对每一种病毒序列和对照序列的捕获探针的微球系统直接杂交。结果具有高度特异性,能够对3个数量级范围内的核酸定量。

    Spiro等建立了对环境PCR产物中的细菌DNA进行多通道定量鉴定的方法,即用4种细菌的16S/23S核糖体DNA(rDNA)的基因内间隔区作为株系鉴定标志,获得极好的序列分辨。他们对从污染地下水中收集的微生物的16SrDNA靶序列的丰度进行多通道定量分析,仅占总DNA0.3%的靶序列可被定量。

    Ye等用多通道ASPE或SBCE的SNP基因分型方法鉴定17种不同的格兰氏阴性或格兰氏阳性细菌的可变的16SrDNA序列。两种方法获得的结果都和直接测序一致。

    DunbarSA等用直接杂交法对和食品病原性疾病有关的细菌病原体进行多通道定量检测。他们设计通用引物,扩增含有能特异性区分E.coli、Salmonella、L.monocytogenes和C.jejuni的序列中23SrDNA的一个区域。这一方法能准确和特异性的鉴别每种细菌,能检测107到108拷贝的扩增靶分子,相当于PCR反应中103E.coli、Salmonella和L.monocytogenes和105C.jejuni的基因组拷贝。

    Diaz和FeLL等用直接杂交法高通量检测毛孢子菌属(TrichospoROn)。这一方法使用48种针对rDNA的D1/D2区、基因内转录的Spacer区域的和基因间的Spacer区的种特异性和群特异性捕获探针,每种都负载在一个特异性微球上。用三对引物同时扩增上述3个区域的片段,随后与负载探针的微球杂交,以多通道的方式检测。这一方法快速特异,能通过一个核苷酸辨别不同菌种,在扩增后只需要不到50分钟就可获得结果。这一方法能检测到107到108拷贝的扩增产物,相当于PCR反应中102基因组拷贝。

     

    4、结语

    人类基因组测序已经完成,丰富的信息加深了我们对基因差异及其与疾病和疾病治疗关系的理解。越来越多的致病基因突变需要鉴定,分子生物学实验室要检测的DNA大幅度增加,迫切需要快速,精确,经济的高通量核酸检测方法。研究表明xMAP平台能充分满足这一需求。随着商业化试剂盒的开发,在实验室开展依赖xMAP技术的核酸检测变得更容易,应用也更加广泛。可以预见,xMAP技术在核酸定量检测和基因表达谱分析等领域具有广阔的应用前景。